獻給初學者:常用的細胞凋亡檢測方法

生物學霸midas2018-04-24 05:01:06

在實驗中經常需要檢測細胞的凋亡情況,這裡總結了幾種常見的凋亡檢測方法,希望能夠幫到你。

一:的形態學檢測


發生凋亡的細胞在形態上有一定的特徵。


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光學顯微鏡和倒置顯微鏡


未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。


染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。


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熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡


一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。


常用的 DNA 特異性染料有:HO 33342(Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與 DNA 的結合都是非嵌入式的,主要結合在 DNA 的 A-T 鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。


Hoechst 是與 DNA 特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度,使用時用 PBS 稀釋,終濃度為 10 μg/ml。


DAPI 為半通透性,用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度,使用終濃度一般為 10 μg/ml。


結果評判


細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ 期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb 期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體(圖 1)。



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透射電子顯微鏡觀察


結果評判


凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象(cavitations)的空泡結構;Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體(圖 2)。



二:Annexin V 法


磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位於細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS 可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中(圖 3)。Annexin-V 是一種分子量為 35~36 KD 的 Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白,能與 PS 高親和力特異性結合。將 Annexin-V 進行熒光素(FITC、PE)或 biotin 標記,以標記了的 Annexin-V 作為熒光探針,利用或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。




碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。


方法

 

懸浮細胞的染色:將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞(0.5~1×106)用 PBS 洗 2 次,加入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V(20 μg/ml)10 μl,室溫避光 30 min,再加入 PI(50 μg/ml)5 μl,避光反應 5 min 後,加入 400 μl Binding Buffer,立即用 FACScan 進行流式細胞術定量檢測(一般不超過 1 h), 同時以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作為陰性對照。


貼壁培養的細胞染色:先用 0.25% 的胰酶消化,洗滌、染色和分析同懸浮細胞。


爬片細胞染色:同上,最後用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。


結果





注意事項


1. 整個操作動作要儘量輕柔,切勿用力吹打細胞。


2. 操作時注意避光,反應完畢後儘快在一小時內檢測。

三:線粒體膜勢能的檢測


線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡,而線粒體跨膜電位(Δψm)的下降,被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件,它發生在細胞核凋亡特徵(染色質濃縮、DNA 斷裂)出現之前,一旦線粒體跨膜電位崩潰,則細胞凋亡不可逆轉。


線粒體跨膜電位的存在,使一些親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide(DiOC6)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC-1)、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質,其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。


方法


將正常培養的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為 Rhodamine 123(1 mM)或終濃度為 DiOC6(25 nM),JC-1(1 mM),TMRM(100 nM),37 °C 平衡 30 min,流式細胞計檢測細胞的熒光強度。


注意事項


1. 始終保持平衡染液中 pH 值的一致性,因為 pH 值的變化將影響膜電位。


2. 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白,他們將與部分染料結合,降低染料的濃度,引起假去極化。

四:DNA 片段化檢測


細胞凋亡時主要的生化特徵是其染色質發生濃縮,染色質 DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂,形成 50~300 kbp 長的 DNA 大片段,或 180~200 bp 整數倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜 (DNA ladder)。


細胞經處理後,採用常規方法分離提純 DNA,進行電泳和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的 DNA ladder。如果細胞量很少,還可在分離提純 DNA 後,用 32P-ATP 和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)標記 DNA,然後進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中 DNA ladder 的形成。


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大分子染色體 DNA 片段的測定


細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為 50~300 kbp 長的 DNA 大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性 DNA 的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分 DNA,DNA 像通過彎管一樣,以其一端指向電場一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為「爬行。因此,細胞凋亡早期產生的 50~300 kbp 長的 DNA 大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。


通常採用脈衝電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈衝電場。每當電場方向改變後,大的 DNA 分子便滯留在爬行管中,直至新的電場軸向重新定向後,才能繼續向前移動。DNA 分子量越大,這種重排所需要的時間就越長。當 DNA 分子變換方向的時間小於電脈衝週期時,DNA 就可以按其分子量大小分開。

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DNA Ladder 測定


方法


收穫細胞(1×107)沉澱→細胞裂解液→13 000 rpm ×5 min→收集上清,加 1% SDS 和 RnaseA(5 mg/ml)56 °C,孵育 2 h→蛋白酶 K(2.5 mg/ml)37 °C,2 h→1/10 體積 3 mol/l 醋酸鈉和 2.5 倍體積的冷無水乙醇沉澱 DNA,4 °C 過夜→14 000 rpm×15 min→最後將沉澱溶解在 TE buffer 中,加 DNA Loading Buffer→1.2% 瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色並照相。


結果


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凋亡細胞 DNA 含量的流式細胞計分析


方法


收集細胞→70% 冷乙醇(PBS 稀釋)4 °C 固定過夜→PBS 洗滌,1 000 rpm × 10 min→RNase A(0.5 mg/ml)37 °C 消化 30 min→PI(50 mg/ml)染色,室溫避光 15 min→FACScan 分析 DNA 亞二倍體的形成及細胞週期的變化。


結果



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ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay


優點:敏感度高,適合於檢測少量樣本,小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五:TUNEL 法


細胞凋亡中,染色體 DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性 3'-OH 末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、鹼性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA 的 3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。


由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂,因而沒有 3'-OH 形成,很少能夠被染色。TUNEL 實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特徵,可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定,並可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛採用。

六:Caspase-3 活性的檢測


Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中 Caspase-3 為關鍵的執行分子,它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3 正常以酶原(32 KD)的形式存在於胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的 Caspase-3 由兩個大亞基(17 KD)和兩個小亞基(12 KD)組成,裂解相應的胞漿胞核底物,最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,Caspase-3 的活性明顯下降。

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Western blot


分析 Procaspase-3 的活化,以及活化的 Caspase-3 及對底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等的裂解。


方法


收集細胞→PBS 洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 電泳→硝酸纖維素膜或 PVDF 膜轉移→5% 脫脂奶粉封閉,室溫 1.5~2 h 或 4 °C 過夜→Caspase-3 多抗或單抗室溫反應 1~2 h 或 4 °C 過夜→TBS-T(含 0.05% Tween 20 的 TBS)洗 3 次,5~10 min/次→HRP-標記的羊抗鼠 IgG 或 AP 標記的羊抗鼠 IgG 室溫反應 1~2 h→ TBS-T 洗 3 次, 5~10 min/次→ECL 顯影或 NBT/BCIP 顯色。

 

結果



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熒光分光光度計分析


活化的 Caspase-3 能夠特異切割 D1E2V3D4-X 底物,水解 D4-X 肽鍵。根據這一特點,設計出熒光物質偶聯的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時,AMC 不能被激發熒光,短肽被水解後釋放出 AMC,自由的 AMC 才能被激發發射熒光。根據釋放的 AMC 熒光強度的大小,可以測定 Caspase-3 的活性,從而反映 Caspase-3 被活化的程度。

 

方法


收穫細胞正常或凋亡細胞→PBS 洗滌→製備細胞裂解液→加 Ac-DEVD-AMC(caspase-3 四肽熒光底物)→37 °C 反應 1 h→熒光分光光度計(Polarstar)分析熒光強度(激發光波長 380 nm,發射光波長為 430~460 nm)。


結果


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流式細胞術分析


方法


收穫細胞正常或凋亡細胞→PBS 洗滌→加 Ac-DEVD-AMC→37 °C 反應 1 h→UV 流式細胞計分析 Caspase-3 陽性細胞數和平均熒光強度。


結果



七:TFAR19 蛋白表達和細胞定位分析


TFAR19(PDCD5)是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因,前期的功能研究表明,它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素(FITC)標記的 TFAR19 單克隆抗體為探針,對細胞凋亡過程中 TFAR19 蛋白的表達水平及定位研究發現,凋亡早期 TFAR19 表達水平增高並出現快速核轉位現象,伴隨著細胞核形態學的變化,持續較長時間,在凋亡小體中仍然可見。


同時我們發現,凋亡早期 TFAR19 蛋白的核轉位早於磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細胞核 DNA 的片段化,提示 TFAR19 蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明,凋亡早期 TFAR19 的核轉位具有普遍意義,不同細胞凋亡早期均出現 TFAR19 高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件,提供了一種新的技術和指標。

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TFAR19 蛋白的細胞定位分析


材料試劑


FITC 標記的單克隆抗體,pH 7.4 、0.15 mol/L PBS,3% 的多聚甲醛,PBS-T(pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 0.2% Tween 20),胎牛血清,熒光細胞洗液(pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 2% 胎牛血清及 0.1% NaN3),FACS 管,Tip 頭,移液器。


儀器


低溫水平離心機,37 °C 水浴箱,熒光顯微鏡,共聚焦激光掃描顯微鏡,流式細胞儀。

 

方法


1.懸浮細胞的染色


(1)收穫正常和誘導凋亡的細胞(0.5~1×106),PBS 洗 2 次,1 000 rpm×10 min。


(2)3% 多聚甲醛冰浴 10 min,PBS 洗 2 次,1 000 rpm×10 min。


(3)加入 PBS-T 溶液,37 °C 孵育 15 min,PBS 洗 2 次,1 000 rpm×10 min。


(4)加入 200 ml 胎牛血清,室溫反應 30 min。


(5)加入 5 ml FITC 標記的 TFAR19 單抗(終濃度為 1:40),4 °C 反應 30 min。


(6)熒光細胞洗液洗 2 次,1 000 rpm×10 min。


將細胞沉澱滴片,熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察 TFAR19 在細胞中的定位。同時用流式細胞儀定量檢測 TFAR19 蛋白的平均熒光強度。




2. 貼壁細胞的原位染色


(1)貼壁生長的對數期細胞鋪在 24 孔或 6 孔板中(內有潔淨蓋玻片),讓其爬片生長,待長到 50%~80 %滿時,凋亡誘導劑處理細胞。

  

(2)將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色,染色步驟同上。

  

(3)將染色的爬片細胞放於一張滴有少量甘油(5 ml)的載玻片上,熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 TFAR19 在細胞中的定位。




3.臨床病理切片的染色、檢測


4.原代細胞的培養、檢測


5.分析 TFAR19 蛋白在人體內各組織器官的分佈及定位

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TFAR19 蛋白的表達與臨床疾病


ELISA 法檢測正常人和疾病狀態下,以及疾病的不同時期,血清中 TFAR19 蛋白水平及其 TFAR19 自身抗體水平。

  

材料和試劑


1. 包被 BufferpH 9.6, 0.05 mol/L 碳酸鹽 Buffer


2. 洗滌液: pH 7.4,0.15 mol/L PBS 含 0.05% Tween 20


3. 封閉液: 3% BSA(用洗滌液配製)


4. 酶標抗體的稀釋:用封閉液稀釋


5. OPD 底物 Buffer:Na2HPO4·12 H2O 1.84 g,檸檬酸 0.51 g,DDW 100 ml


6. 顯色液(現配現用):底物 Buffer 10 ml,OPD 2 mg,30% H2O2 2 ml


7. 終止液 2 mol/L H2SO4


8. 重組人 TFAR19,HRP 標記的羊抗人 IgG9 ELISA 板,Tip,移液器,ELISA Reader(OD 490 nm),洗板機

  

操作步驟


1. 用包被 Buffer 稀釋的重組人 TFAR19(1 mg/ml)包被 ELISA 板,100 ml/well,37 °C 孵育 2 h 或 4 °C 過夜(一般 24 h 以上)。


2. 洗滌 Buffer 洗板三次,加入封閉液,200 ml/well , 37 °C 孵育 2 h 或 4 °C過夜。


3. 洗滌 Buffer 洗板三次,加入不同稀釋度的病人血清(3 個重複孔)100 ml/well ,37 °C 孵育 1 h。設包被 Buffer、洗滌 Buffer 、封閉液為陰性對照。


4. 洗滌 Buffer 洗板三次,加入 1:2 500 稀釋的 HRP 標記的抗人 IgG, 100 ml/well,37 °C 孵育 1 h。


5. 洗滌 Buffer 洗板三次,加入顯色液,100 ml/well,避光反應 10~15 min。


6. 加入 H2SO4 終止反應,50 ml/well。


7. ELISA Reader 讀取 OD 490 光密度值,分析和比較病人血清和正常血 清中 TFAR19 自身抗體的表達水平。


8. Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的 TFAR 19 蛋白的表達水平。


參考文獻 

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507



文章來源:丁香園站友 midas

圖片來源:丁香園站友 midas

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