三小組未能重現韓春雨論文結果,《自然-生物技術》稱1月公佈調查進展

科學人2018-08-19 01:37:28

11月29日,《自然-生物技術》發表題為《利用Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) 未能檢測到DNA引導的基因組編輯》的通訊文章[1],稱三個實驗組獨立對韓春雨今年五月初發表的論文結果[2]進行了重複實驗,但都無法重現韓春雨在原論文中宣稱的結果。期刊還同時發佈一份聲明,稱會對批評進行審慎和全面的評估,同時也給韓春雨等原論文作者提供機會展開調查,並在2017年1月底之前完成其調查。

來自三個研究組的陰性結果

今年5月,河北科技大學韓春雨等人在《自然-生物技術》期刊上發表論文,稱基於5'端磷酸化的gDNA序列和NgAgo蛋白的基因組編輯系統能在哺乳動物細胞系中對基因組進行編輯。

根據這篇論文提供的信息,來自德國弗萊堡大學的託尼·卡索曼(Toni Cathomen)研究組、美國梅奧醫院的斯蒂芬·埃克爾(Stephen C. Ekker)研究組以及韓國首爾大學的金鎮秀(Jin-Soo Kim,音譯)研究組各自合成了同樣的5'端磷酸化的gDNA序列,同樣使用韓春雨提供給Addgene信息庫的NgAgo載體,並且將其轉染到同樣的人類細胞系中。在對照實驗已證實5'磷酸化的gDNA及NgAgo質粒被有效轉入細胞,NgAgo蛋白也已獲得表達的情況下,這三個研究組進行了多項實驗,但無一成功檢測到對目標基因組序列的編輯。

三個研究組的實驗結果以通訊文章形式發表在了《自然-生物技術》期刊上。這也是韓春雨NgAgo論文所在的期刊。圖片來源:Nature Biotechnology

卡索曼的研究組在HeLa和HEK293T兩種細胞(在韓春雨論文中均有使用)中通過質粒表達綠色熒光蛋白,再試圖按照韓春雨在其論文中提供的實驗設置,利用NgAgo系統對編碼綠色熒光蛋白的基因進行編輯,但綠色熒光蛋白的表達並沒有因此呈現任何統計學上顯著的減少。但利用SpCas9系統進行編輯,則讓相同細胞系中的綠色熒光蛋白表達顯著降低。

埃克爾的研究組使用了韓春雨在其論文中用到的5條gDNA序列及NgAgo載體,在三種人類細胞系(在韓春雨論文中均有使用)中進行實驗,試圖對基因組中的DYRK1A基因(即韓春雨在論文中設定的編輯目標)實施編輯。他們的45次實驗均以未能檢測到的DNA序列變化而告終(檢測閾值為2%),而韓春雨的原論文稱編輯效率大於20%。“假設NgAgo引起(DNA的)插入/缺失的真實普遍性為0.20,並滿足正態分佈,我們的零假設是‘NgAgo不能在人類細胞中以大於等於0.20的比率引起插入/缺失’。在對45個獨立樣本進行測試後,我們觀察不到任何插入/缺失證據的可能性是p = 0.8^45 = 4.4 × 10^(–5)。”他們在通訊文章中寫道。

埃克爾的研究結果提示,NgAgo和gDNA並不能在目標基因序列中引起插入/缺失,儘管他們選取的NgAgo載體、細胞系、目標基因序列、gDNA序列等都與韓春雨在論文中使用的一致。圖片來源:參考文獻[1]

金鎮秀的研究組利用NgAgo系統,在HeLa和HEK293T兩種細胞中進行了實驗,試圖編輯韓春雨在論文中稱成功編輯的四個人類基因位點(DYRK1A, EMX1, GATA4, GRIN2B)。但最終,無論是通過T7E1酶切法還是通過深度測序檢查,都沒能檢測到NgAgo系統在上述四個位點引起的任何編輯。作為對照,利用SpCas9系統則能對相應位點引入不同程度的插入/缺失。

在包括上述實驗在內的種種嘗試中,卡索曼、埃克爾和金鎮秀研究組獲得的結果都指向一個結論:只通過共導入NgAgo質粒和5'端磷酸化的單鏈gDNA,並不足以按韓春雨原論文中所稱的頻率引起基因編輯。

《自然-生物技術》
發表“編輯部關注”及聲明

在發表上述通信文章的同時,《自然-生物技術》也刊登了一則“編輯部關注”[3]。中文譯文全文如下:

編輯部關注:利用NgAgo進行DNA引導的基因組編輯

《自然-生物技術》的編輯就上述論文發表“編輯部關注”,以提醒讀者人們對原論文結果的可重複性存有擔憂。此次,我們發表三個團隊的實驗結果(http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3753),他們都設法去重複韓春雨及同事發表在原論文中圖4的結果,這一關鍵圖表展示了對哺乳動物細胞內源性基因位點的編輯。這些團隊無一能在任何位點,或在任何高於檢測方法敏感度的條件下觀察到NgAgo所誘發的變異。另外一組作者在《蛋白質與細胞》期刊也報告了類似結果(doi:10.1007/s13238-016-0343-9)。

我們和論文作者進行了溝通,他們正在調查造成可重複性缺乏的潛在原因。我們向其告知了這一聲明。儘管調查仍在進行中,但韓春雨和沈嘯同意我們發表的這一編輯部關注,高峰、姜峰和武永強則認為目前並不合適。這些調查一旦完成,我們會向讀者提供最新信息。

11月16日,《蛋白質與細胞》(Protein & Cell)期刊在線發表了一封讀者來信[4],作者為包括北京大學魏文勝研究員在內的20位科學家。他們在信中反映,各自所在的研究組均無法重現韓春雨在NgAgo論文中述及的結果,呼籲“原始論文的作者澄清NgAgo的不確定性,併為重複出最初那些重要的結果提供所有必要的細節”。11月11日,南通大學劉東團隊也曾在《細胞研究》上發表致編輯信[5],結果顯示NgAgo系統無法用於編輯斑馬魚基因組。

加上今天發表在《自然·生物技術》上的通訊文章,發表在國際學術期刊上、表明NgAgo系統未能進行基因組編輯的文章已經有三篇。有鑑於此,《自然-生物技術》發表了一則最新聲明[6]:

關於韓春雨及同事發表於《自然-生物技術》的“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”(利用NgAgo進行DNA引導的基因組編輯)一文的聲明 

《自然-生物技術》今天就此前發表的韓春雨及同事所著論文“利用NgAgo進行DNA引導的基因組編輯”發表了“編輯部關注”,並發表Toni Cathomen及同事的通信文章,題為 “利用Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) 未能檢測到DNA引導的基因組編輯”。

《自然-生物技術》已審慎考慮過所有關於韓春雨及同事原著論文的評論。在任何情況下,如果一篇論文在發表後遭到批評,我們都會對各種批評進行審慎和全面的評估,此次也不例外。今天,我們不僅發表了Cathomen及同事的通訊文章,這可能會否定原論文所稱的有效編輯內源性基因的這一主要發現;而且我們還連同該通訊文章一起發表了“編輯部關注”,以確保讀者知曉Cathomen及同事的論文,以及另外一篇在別處發表的論文(doi:10.1007/s13238-016-0343-9)所提出的擔憂。目前,原論文的作者中有兩位,即韓春雨和沈嘯,同意我們發表的“編輯部關注”,而高峰、姜峰和吳永強則認為這並不合適。

《自然-生物技術》認為,讓原作者在能力所及的情況下對上述通信文章所提出的擔憂展開調查,並補充信息和證據來給原論文提供依據是非常重要的。因此,我們將繼續與原論文的作者保持聯繫,併為他們提供機會,以在2017年1月底之前完成其調查。屆時,我們會向公眾公佈最新進展。


(編輯:wuou)

參考文獻:

1.Seung Hwan Lee, et al. "Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute". Nature Biotechnology (2016).

2.Gao, Feng, et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute." Nature biotechnology (2016).

3."Editorial Expression of Concern: DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute." Nature biotechnology (2016).

4.Burgess, Shawn, et al. "Questions about NgAgo." Protein & Cell (2016): 1-3.

5.Qi, Jialing, et al. "NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish." Cell Research (2016).

6."Statement regarding 'DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute' by Han Chunyu and colleagues, published in Nature Biotechnology" Nature biotechnology (2016).

文章題圖:參考文獻[1]

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