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鵝眼看電影2017-05-31 14:29:12



從14年 CRISPR 大規模篩選的第一篇文章以來,目前為止,影響十分以上的文章就有150篇以上。這裡我們摘譯了最近發表一份關於 CRISPR/Cas9篩選在癌症中的應用的工作,以饗讀者。

自本世紀初大規模詳細的描述性癌症基因組學研究,如癌症基因組圖譜( TCGA )問世以來,世界各地的實驗室一直在努力使這些數據變得有用。與互補的功能基因組數據相比,一個新的方法是基於CRISPR/Cas9的文庫篩選在細胞系中癌症相關性狀的應用。這樣的篩選可以揭示腫瘤發生和轉移的全基因組抑制因子。在這裡,描述了在細胞系中使用慢病毒文庫進行大規模篩選。


蛋白質編碼基因中產生敲除突變


CRISPR/Cas9系統通常用於在特定位點引入雙鏈DNA ( dsDNA )斷裂。dsDNA斷裂可以通過非同源末端連接( NHEJ )來修復,這是一個容易出錯的過程,通常會在切割位點留下插入/刪除( in/del )突變,導致開放閱讀框( ORF )中的移碼突變。全基因組範圍的gRNAs文庫非常有用,其中基因組的每個基因都被多個gRNAs靶向。這些gRNAs被遞送到慢病毒載體中的細胞,在某些情況下,慢病毒載體在同一載體上表達人源化Cas9。在其他情況下,Cas9在文庫轉導之前被遞送至細胞。將這些gRNA文庫轉導到細胞中已被用於體外細胞轉化、耐藥性和體內腫瘤形成的選擇。


篩選細胞的選擇和選擇的表型細節是成功的關鍵決定因素


所使用的細胞需要適合被慢病毒載體感染,需要易於大量生長,並且通常需要顯示研究中表型自發發展的低頻率,也就是說很少有細胞出現預期表型。由於相對較少的gRNAs能夠誘導新的表型,新現象類型的自發出現率應該較低,否則在篩選上會觀察到許多假陽性。

另外需要考慮因素是所用細胞的倍性。那些存在於每個細胞許多表達拷貝中的基因(許多超過兩個)可能不會因為拷貝太多而被完全剔除。也有證據表明,如果一個gRNA在一個細胞中多次切割,可能會導致細胞死亡。這是對擴增區域基因的關注。選擇用於研究的表型的第三個考慮是確保選擇足夠數量的轉導細胞。如果細胞在小鼠或其他動物模型中受到體內選擇性壓力,這一點尤為重要。當細胞被注射到動物體內時,許多細胞會立即死亡,因此轉導細胞群體可能會經歷群體“瓶頸”在這種情況下,並非所有的gRNAs都有機會突變其目標基因併產生生物效應。因此,對於陽性選擇方案,必須考慮正確選擇細胞系和進行選擇分析。


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